Abstract

Purpose The purpose of this study was to analyze types of germs in normal oral environment in vitro with apply of absorbance technology.

Material and methods Total 5 of germs in typical oral environment selected. Each germs were cultured into low concentration to high concentration with 10 level. Absorbance test was performed for each cultured well with 300~900nm with 1nm interval.

Result No significant difference between each wave length. However it was able to pick up difference in existence and amount of germs in each well.

Conclusion In this study, Using absorbance technology for monitoring oral environment was concluded as plausible, but need more technical advancement for apply to on-board or carry around.

• 고려대학교 일반 대학원 보건과학과 치의기공전공1
   Department of Dental Lab. Science & Engineering, College of Health Science, Graduate School, Korea University
• 치과캐드캠기자재 품질평가위원회2
   Evaluation Research Society of Dental CAD/CAM Device and Materials
• 주식회사 큐라움3
   CURAUM Inc. Research Lab

서론
최근 구강 내 존재하는 세균이 구강뿐만 아니라 뇌 속에 존재하여 알츠하이머의 전형적인 뇌 변화를 촉발한다는 연구 결과[1]가 공개되었다. 이러한 연구 결과는 관련 학계의 “세균 감염이 알츠하이머의 발병에 일조한다”라고 제안하는 연구 중 가장 최신의 연구 결과이다. 또 다른 구강 내 세균이 구강 외에 다른 부분에 영향을 미치는 연구 결과로는 최근 중국의 전장 의과대학 연구팀이 발견한 혀에서 발생하는 미생물을 관찰하여 췌장암의 조기발견이 가능하다는 결과[2]이다. 췌장암은 환자의 생존율이 매우 낮은 암으로 췌장의 위치가 인체의 가운데 후방에 위치하여 그 조기발견이 매우 어렵고, 수술을 통해 제거하더라도 그 재발률이 높아 환자의 완치를 보장할 수 없는 암의 일종이다. 뿐만 아니라 구강 내에 잠복해있는 Streptococcus tigurinus가 심장질환과 뇌수막염과 같은 중증질환을 유발한다는 연구 결과[3] 등 구강 내 세균이 인체의 다른 부분에 영향을 미쳐 질병을 유발하는 연구의 결과는 지금까지 많이 보고된 바가 있다.
이러한 연구들은 최근 그 보고가 증가하고 있으며, 지금까지 밝혀진 바가 없는 중증질환의 기전을 증명하고 정복할 수 있는 새로운 실마리를 제공할 것이다. 이처럼 구강 내 세균의 감지와 그 모니터링에 관한 관심이 증폭되고 있지만, 아직까지 우리의 일상생활과 무관하게 느껴진다. 하지만 교정장치, 보정장치, 코골이 방지장치, 마우스 가드 등의 구강 내 장치를 사용하는 경우 잘못된 관리를 통해 구강 내 장치가 구강 내 세균을 배양하는 저수지와 같은 역할을 하게 되어 다양한 중증질환을 유발할 수 있는 세균 덩어리가 될 수 있다.
 따라서 해당 연구에서는 구강 내에서 흔하게 발견되는 세균을 대상으로 흡광도 검사를 통해 구강 내 세균 환경을 간접적으로 알 수 있는 솔루션의 개발이 가능한지 그 가능성을 점쳐보고자 한다.

연구대상 및 방법
1. 구강 내 세균의 선정 및 배양
선행연구[4]를 참고하여 구강 내 존재하는 대표적인 균주를 선정하였으며, 선정된 세균은 다음과 같다.
 

각 세균은 세균을 다룰 수 있는 연구실안전등급 2등급의 실험실에서 진행되었으며, 세균주와 함께 동봉된 매뉴얼의 지침에 따라 숙련된 연구자가 배양을 진행하였다. 농도에 따른 흡광도 분석의 차이가 발생하는지 알아보기 위해 배양은 각 균주별 10단계로 농도를 나누어 배양하였다.

2. 흡광도 분석
각 배양된 균주는 아래 그림과 같은 모습으로 흡광도 분석을 시행하였으며, 흡광도 분석은 TECAN Ltd. 의 Infinite  200 pro 장비를 사용하였다.
각 배양지별 15분에서 길게는 20분의 시간이 걸리기 때문에 최대 17시간의 긴 시간이 소요되므로 배양지를 흡광도 분석 장치에 넣고 자동으로 분석을 시행하였다.

결과
각 균주별 흡광도 분석의 결과는 아래 그래프들과 같다.
모든 균주가 300~900nm대의 파장에서 세균의 유무를 확인할 수 있는 수준의 결과가 도출되었으며, 각 농도별로 차이가 나타나는 것을 알 수 있었다. 따라서 여러 연구에서 공통적으로 가장 많이 분석하는 400~600nm대의 결과를 확대하여 관찰하였다.
위 그래프들과 같이 동일한 파장 구간에서 균주와 농도별 확연한 차이가 있음을 알 수 있다.

고찰 및 결론
해당 연구에서는 구강 내 세균들의 흡광도 분석을 통한 간접적인 검출이 가능한지를 알아보는 실험이 진행되었다. 흡광도 분석 결과를 통해 1차적으로 해당 균이 존재하는지, 어느정도 오염이 되었는지 등을 확인할 수 있는 수단으로 활용할 수 있는 것으로 보인다. 하지만 연구에 사용한 장비는 매우 고가의 장비로 우리가 일상생활에서 자주 사용할 수 있는 장비는 아니다. 그러나 흡광도 분석 자체의 원리는 매우 간단하기 때문에 이 점을 응용한다면 사용이 손쉽고 가격이 저렴한 구강 내 장치를 통한 간접적인 검출과 모니터링을 할 수 있는 장비의 개발이 가능할 것이다.

이번 연구의 제한점은 세균의 단일 배양으로 인해 실제 구강 내 환경의 재현을 완벽하게 할 수 없다는 것이다. 실제 구강 내 환경은 치석, 치태, 음식물, 상주균, 타액, 기타 단백질 입자 등의 다양한 입자들이 함께 존재하는 환경이기 때문에 이번 연구처럼 단일 균주만을 배양하여 측정하는것은 실제 임상에 적용하기에 어렵다. 기다란 막대기 형태의 세균을 흡광도 분석을 통해 분석한다고 할 때, 막대기 형태의 세균이 가로로 서있는 형태와 장축방향을 정면으로 하여 누워있는 형태는 광원으로부터 나오는 빛줄기로 인해 발생하는 그림자의 형태가 다르므로 정확한 분석이 불가능하다[Fig. 5]. 동일한 종류의 세균만을 분석하는 경우에도 이러한 문제가 발생하며 다양한 물질이 섞여 있는 구강 내 환경의 경우 흡광도 분석을 통해 목표가 되는 세균만을 골라내어 분석하는 것은 매우 어려울 것이다. 전기영동을 통한 세균의 정렬을 통해 정확한 개수를 세는 것이 가능하지만, 전기영동은 고전류를 사용하는 위험한 기술로 항시 구강 내 환경을 모니터링 하기 위해 사용하는 기술로 활용하기는 어렵다. 하지만 최근 광원과 센서의 개선을 통해 사용이 쉽고 간편한 흡광도 분석 솔루션이 개발되고 있기 때문에 차후 크기가 비슷한 입자들을 구분하고 특정할 수 있는 고도화 연구가 추가적으로 진행된다면 구강 내 장치를 통해 간접적인 구강 내 환경의 모니터링과 나아가 심각한 중증질환의 조기발견이 가능한 장치의 개발이 가능할 것이라고 예상한다.

Acknowledgement
본 연구는 구강 내 장치의 새로운 관리 솔루션 개발을 위한 주식회사 큐라움의 지원을 받아 진행되었으며, 물심양면으로 지원해주신 큐라움사의 대표님과 임직원님들께 감사의 말씀을 드립니다.

참고문헌
① Stephen S. Dominy, Casey Lynch, Florian Ermini, Malgorzata Benedyk, Agata Marczyk, Andrei Konradi, Mai Nguyen, Ursula Haditsch, Debasish Raha, Christina Griffin, Leslie J. Holsinger, Shirin Arastu-Kapur, Samer Kaba, Alexander Lee, Mark I. Ryder, Barbara Potempa, Piotr Mydel, Annelie Hellvard, Karina Adamowicz, Hatice Hasturk, Glenn D. Walker, Eric C. Reynolds, Richard L. M. Faull, Maurice A. Curtis, Mike Dragunow and Jan Potempa  Porphyromonas gingivalis in Alzheimer뭩 disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors Science Advances 23 Jan 2019: Vol. 5, no. 1, eaau3333 DOI: 10.1126/sciadv.aau3333
② Haifeng Lu, Zhigang Ren, Ang Li ORCID Icon, Jinyou Li, Shaoyan Xu, Hua Zhang, Jianwen Jiang ORCID Icon, Jiezuan Yang, Qixia Luo, Kai Zhou ORCID Icon, Shusen Zheng & Lanjuan Li Tongue coating microbiome data distinguish patients with pancreatic head cancer from healthy controls Article: 1563409 | Received 18 Jul 2018, Accepted 17 Dec 2018, Published online: 28 Jan 2019
③ Andrea Zbinden, Nicolas J. Mueller, Philip E. Tarr, Cathrin Spr?r, Peter M. Keller, Guido V. Bloemberg Streptococcus tigurinus sp. nov., isolated from blood of patients with endocarditis, meningitis and spondylodiscitis December 2012, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 62: 2941-2945, doi: 10.1099/ijs.0.038299-0
④ Rita Regina Souza Lamas, Mabel Miluska Suca Salas, Tatiana Pereira Cenci, Marcos Britto Corr?, Rafael Guerra Lund Removable orthodontic appliances: frequency and cleaning agents used by students and recommended by dentists Brazilian Journal of Oral Sciences Volume 15 January ?March 2016 DOI: https://doi.org/10.20396/bjos.v15i1.8647093